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  2. 泳動条件とバッファー組成

一般的なバッファー組成と泳動条件

SDS-PAGEmini(Laemmli系)
サンプルバッファー 泳動バッファー 泳動条件

0.5MTris-HCl(pH6.8).1.25ml
グリセロール ..........1.0ml
10%SDS ............2.0ml
2-メルカプトエタノール. 0.5ml
0.1%BPB ..........0.25ml

蒸留水で10mlにする。
＊サンプルをサンプルバッファーで5倍以上に希釈後、沸騰水中で約5分加熱。＊非還元状態で泳動する場合は2-MEを除く。

トリス ...........3.0g
グリシン .........14.4g
SDS ............1.0g

蒸留水で1000mlにする。

1.0mm厚1枚 ... 18mA定電流
1.5mm厚1枚 ... 27mA定電流
泳動時間：70-120分
予想電圧：

開始時70-100V
終了時160-210V
または125V定電圧
泳動時間：70-120分
予想電流（1mm厚1枚）：
開始時　30-40mA
終了時　8-12mA
NON-SDS-PAGEmini(Native系)
サンプルバッファー 泳動バッファー 泳動条件

グリセロール ........1.0ml
0.1%BPB .........0.25ml

蒸留水で10mlにする。
＊サンプルをサンプルバッファーで5倍以上に希釈する。

トリス .........3.0g
グリシン .......14.4g

蒸留水で1000mlにする。

1.0mm厚1枚 ... 18mA定電流
1.5mm厚1枚 ... 27mA定電流
泳動時間：70-120分
予想電圧：
開始時70-100V
終了時160-210V

または125V定電圧
泳動時間：70-120分
予想電流（1mm厚1枚）：
開始時　30-40mA
終了時　8-12mA
Peptide-PAGEmini(Tricine系)
サンプルバッファー 泳動バッファー 泳動条件

SDS ................ 0.4g
0.5MTris-HCl(pH6.8). 1.0ml
グリセロール ..........1.2ml
2-メルカプトエタノール ..0.2ml
0.05%BPB ..........0.3ml

蒸留水で10mlにする。
＊サンプルをサンプルバッファーで5倍以上に希釈後、沸騰水中で約5分加熱する。

上部バッファー（陰極側）
トリス ...... 12.1g
トリシン ..... 17.9g
SDS ...... 1.0g
---------------------
蒸留水で1000mlにする。


下部バッファー（陽極側)
トリス ...... 24.2g


---------------------
蒸留水で500mlにし、溶解後HClでpH8.9に合わせる。
次に蒸留水で1000mlにする。

150V定電圧
リミッター90mAに設定
(1.0mm厚1枚）
泳動時間：50-60分
予想電流（1mm厚1枚）：

開始時　80-90mA
終了時　50-70mA
TBE-PAGEmini(TBE系）
サンプルバッファー 泳動バッファー 泳動条件

0.1%BPB .......... 2.0ml
0.5%キシレンシアノール 2.0ml
グリセロール .........5.0ml

蒸留水で10mlにする。
＊サンプルに1/10量のサンプルバッファーを加える。

トリス ...... 10.78g
ホウ酸 ...... 5.5g
EDTA ...... 0.83g

蒸留水で1000mlにする。

1.0mm厚1枚 ... 20mA定電流
泳動時間：40-50分
予想電圧：

開始時 160-200V
終了時 200-260V
IEF-PAGEmini　(pH3-10の場合)
サンプルバッファー 泳動バッファー 泳動条件

ServalytpH3-10 ... 0.2ml
グリセロール ......... 3.0ml

蒸留水で10mlにする。
＊pH3-7のゲルを使用する場合はServalytのレンジをpH3-7にする。
＊サンプルをサンプルバッファーで5倍以上に希釈する。

上部バッファー（陰極側）
0.05M ... NaOH

下部バッファー（陽極側）
0.01M ... リン酸
＊1%CAPSをサンプルウェル中に満たした後、サンプルを添加。次に泳動バッファーを注ぐ。

予想電流：（1mm厚1枚）

  • 100V-30分：
    • 開始時 6mA
    終了時 3mA
  • 200V-30分：
    • 開始時 4mA
    終了時 2mA
  • 500V-60分：
    • 開始時 4mA
    終了時 2mA

    泳動時間：120分
    ブロッティング（タンパク質）
    ブロッティングバッファー ブロッティング条件

    トリス ... 3.02g
    グリシン ... 14.4g
    メタノール ... 200ml

    蒸留水で1,000mlとする。

    MW10,000-150,000の場合、定電流 180mA
    ブロッティング時間 60分

    MW150,000以上の場合は定電流 180mA
    ブロッティング時間 90分
    または
    定電圧　5-10Vで30分、以後 25-30Vで約 60分